Plasmonenbasierte Zelltransfektion im Hochdurchsatz mittels ultrakurzer Laserpulse

Ein wichtiger Bereich der Molekularmedizin ist die genetische Veränderung von Zellen durch Transfektion. Hier bieten Primär- und Stammzellen großes Potential, um gentherapeutische Ansätze zu entwickeln. Ferner kann das Einschleusen von Nukleinsäuren wie siRNA im Hochdurchsatz zur Identifizierung der Funktion von Zielgenen und damit zur Wirkstofffindung dienen. Etablierte Methoden, wie Elektroporation oder virale Transduktion, sind für diese Transfektionsanwendungen nicht immer geeignet. Hier bietet die fs-Optoinjektion die bisher beste Alternative der laserbasierten Verfahren. Jedoch handelt es sich um eine Einzelzelltransfektion mit geringem Durchsatz. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung einer plasmonenbasierten Transfektionsmethode im Hochdurchsatz mit hoher Effizienz bei geringer Toxizität. Ebenfalls sollte die Methode selektiv und zelltypunabhängig sein. Um Nukleinsäuren in Zellen einzuschleusen, muss die Zellmembran für diese permeabilisiert werden. Die Interaktion von ultrakurzen Laserpulsen mit membranlokalisierten Goldnanopartikeln führt zur lokalen, transienten Membranperforation. Durch das Abrastern der Zellen mit einem schwach fokussierten Laserstrahl wird so ein hoher Durchsatz erreicht. Mit einem fs-Laser wurden die optimalen Parameter für eine transiente Permeabilisierung der Zellmembran evaluiert und für die Transfektion von Zelllinien sowie Primär- und Stammzellen angewendet. Diese Parameter zeigten keine negativen Auswirkungen auf die Nanopartikel, die Zellvitalität oder auf die einzubringenden Moleküle. Die Transfektionseffizienz von Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen lag bei unter 1 %. Kleinere Moleküle wie siRNA konnten mit einer Effizienz von mehr als 90 % bei einer Zellvitalität von 93 % in die Zellen eingebracht werden. Durch eine siRNATransfektion kam es in Tumorzellen zur Suppression des Onkogens HMGA2 um 50 %. Auch mit einem ps-Laser konnte eine effiziente Gensuppression in drei Zelllinien mit verschiedenen siRNA bei geringer Konzentration (0,3 nM) erreicht werden. Die Transfektion von primären Neuronen mit fluoreszenzmarkierter siRNA erfolgt mit einer Effizienz von 70 %. Eine selektive Zellmanipulation wurde durch die gezielte Bestrahlung oder durch Markierung der Zellen mit Nanopartikeln gezeigt. Ebenfalls wurden zwei weitere Transfektionskonzepte für den Hochdurchsatz, mittels struktureller Oberflächen und Glaskugeln, getestet. Grundlegende Untersuchungen deuten auf Nahfeldeffekte als initialen Mechanismus der Membranpermeabilisierung hin. Es wurden eine Öffnungszeit der Membran von 61 ms und eine minimale Porengröße von 28 nm abgeschätzt, durch die Moleküle bis 2000 kDa ins Zytoplasma diffundierten. Dabei hat die Ladung der Moleküle vermutlich einen Einfluss auf die Effizienz. Mit der Entwicklung eines Funktionsmusters ist es gelungen, die plasmonenbasierte Transfektion von kleinen Molekülen im Hochdurchsatz für Anwendungen in der Klinik oder im Genlabor als Alternative einzusetzen. Die erzielten Ergebnisse stellen einen erheblichen Fortschritt bei der Etablierung von laserbasierten Methoden dar und eröffnen somit neue Wege in der Grundlagenforschung, der Molekularmedizin sowie für die in vivo Anwendung.