Analyse des Substratspektrums der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum

Der konditionale Abbau von Proteinen durch ATP-abhängige Proteasen ist ein wichtiges regulatorisches Prinzip. Mit ClgR, dem Transkriptionsregulator von Genen, die an der Proteolyse und der DNA-Reparatur beteiligt sind, und GlnK, dem PII-Typ-Regulator der Stickstoffmangel-Antwort, sind bereits zwei Substrate der ClpCP-Protease aus Corynebacterium glutamicum bekannt. Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung weiterer Substrate von ClpCP und die Bestimmung von Sequenzmotiven innerhalb dieser Substrate, die für eine Erkennung durch ClpC wichtig sind. Folgende Ergebnisse wurden dabei erzielt: 1. Zur Co-Reinigung von Substraten mit inaktiven ClpP-Derivaten, bei denen der katalytisch aktive Serin-Rest durch einen Glycin-Rest ersetzt worden war und die einen C-terminalen StrepTag-II trugen, wurden die beiden so genannten Substratfallenstämme ClpCP1TRAP und ClpCP2TRAP konstruiert. StrepTactin- Affinitätschromatographie von Extrakten dieser Stämme führte zur Co-Reinigung von 61 Proteinen mit ClpP1*-ST bzw. ClpP2*-ST, von denen 14 in mindestens fünf der zehn Reinigungen mit inaktivem ClpP1 und ClpP2 auftraten. Die Proteine konnten in unterschiedliche Funktionsklassen wie Translation, Chaperone, Aminosäuremetabolismus und Energiemetabolismus eingruppiert werden. Eine Co- Reinigung war auch mit ClpP-Derivaten möglich, die den Serin-Glycin-Austausch nicht besaßen, was auf eine Inaktivierung dieser Derivate bereits durch den Cterminalen StrepTag-II hindeutet. 2. Kontrollexperimente unterstützten eine Spezifität der Co-Reinigung dieser Proteine für ClpP1 und ClpP2. Die plasmid-kodierte E1-Untereinheit des α-Ketoglutarat- Dehydrogenase-Komplexes (OdhA) mit C-terminalem StrepTag-II wurde ohne Co- Reinigung weiterer Proteine aus demselben Stammhintergrund isoliert wie ClpP1*- ST oder ClpP2*-ST. Eine Co-Reinigung von Proteinen mit prozessiertem ClpP1, das ein N-terminales StrepTag-II trägt, war ebenfalls nicht möglich. 3. Aus den mit ClpP co-gereinigten Proteinen wurden 10 N-terminale und 10 Cterminale putative ClpC-Erkennungssequenzen abgeleitet. Durch Bestimmung der Halbwertszeit von Fusionsproteinen mit den 10 N-terminalen Sequenzmotiven konnten acht Motive bestimmt werden, die in Anwesenheit von ClpC einen negativen Einfluss auf die Stabilität der Fusionsproteine hatten. Diese Motive könnten also Erkennungssequenzen von ClpC darstellen.