Synthese und Evaluierung von fluorophormarkierten Nukleotiden und Oligoribonukleotiden

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden zwei Projekte bearbeitet. Zum Einen wurden chemische Primerverlängerungsreaktionen mit fluorophormarkierten Nukleotiden untersucht. Zum Anderen wurden Oligoribonukleotide synthetisiert, die eine sequenzspezifische Inhibierung der Genexpression über den RNA-Interferenz-Mechanismus ermöglichen, dabei aber kaum das angeborene Immunsystem stimulieren. Bei der chemischen Primerverlängerung handelt es sich um eine enzymfreie Variante einer Reaktion, die von der Natur bei der Replikation des genetischen Materials eingesetzt wird. Im vorliegenden Fall wurden auf einem DNA-Templatstrang kurze, 3'-aminoterminale Oligonukleotide (Primer) mit Aktivestern von Mononukleotiden umgesetzt. Dabei kam es zum sequenzspezifischen Einbau des Nukleotids, dessen Kernbase komplementär zur Templatbase war. Um diese Reaktion zur optischen Auslesung von Sequenzinformation nutzen zu können, wurden erstmals Derivate von 3'-Acylamido-2',3'-dideoxynukleotiden mit BODIPY-Farbstoffen als Fluorophor synthetisiert und charakterisiert. Diese konnten, ebenso wie die zuvor beschriebenen Aktivester mit Cyaninfarbstoffen, bzw. photolabil-verknüpfte Fluorophore zu Aktivestern umgesetzt und emplatgesteuert eingebaut werden. Eine der Heraus-forderungen der vorliegenden Arbeit war es, die chemischen Primerverlängerungs- reaktionen auf Oberflächen durchzuführen, die anschließend ortsspezifisch ausgelesen werden können. Dazu wurden Oberflächen aus Glas, Gold und verschiedene Partikel mit immobilisierten Oligonukleotiden getestet. Durch massenspektrometrische in situ-Analyse auf Goldoberflächen konnte gezeigt werden, dass hohe Fluoreszenz-Hintergrundsignale durch Adsorption von Monomeren verursacht werden und nicht durch einen Fehleinbau gegenüber einer nichtkomplementären Templatbase. Die besten Ergebnisse wurden auf Sepharose- partikeln bei fünfminütiger Reaktion im pyridinhaltigen Reaktionsmedium erhalten. Hier war das erwünschte Fluoreszenssignal um bis zu einer Größenordnung stärker als das Hintergrundsignal. Bei der Untersuchung der synthetischen RNA-Stränge war das Ziel die Stimulierung des Immunsystems bei der Gabe von genexpressionsregulierenden Sequenzen zu reduzieren während deren Fähigkeit zur Unterdrückung der Genexpression erhalten bleiben sollte. Hier zeigte sich, dass eine Kombination aus 2'-Desoxyriboseresten und einer Methylgruppe an der 5-Position der Pyrimidine, wie im Fall des Thymidins, dieses Potential besitzen. Die Reduktion der immunstimulierenden Nebenwirkung der Thymidin-enhaltenden RNA-Stränge konnte für verschiedene immunstimulierende Sequenzmotive gezeigt werden. Wenn in beide Stränge eines RNA-Duplexes Thymidin statt Uracil eingebaut wurde, konnte die immunstimulierende Wirkung der RNA noch weiter gesenkt werden. Das „Gene-Silencing“- Potential blieb dabei fast unverändert erhalten. Zudem lassen die berechneten als auch die experimentell ermittelten Schmelzpunkte vermuten, dass immunstimulierende RNA gefaltete Strukturen einnimmt, was wichtig für die Erkennung durch Rezeptoren des angeborenen Immunsystems sein dürfte.