Charakterisierung tierischer Zellkulturen anhand einer Quantifizierung intrazellulärer Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel

Anhand einer Charakterisierung tierischer Zellkulturen basierend auf den intrazellulären Konzentrationen von Metaboliten aus dem Zentralstoffwechsel sollte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zum besseren Verständnis des Stoffwechsels von kultivierten Zellen geleistet werden. Hierfür war es allerdings zuerst erforderlich, eine verlässliche analytische Methode zur Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten zu entwickeln. Im ersten Abschnitt dieser Arbeit wurde eine Anionen-Austausch Chromatographiemethode zur Trennung und Detektion von organischen Säuren, Zuckerphosphaten und Nukleotiden etabliert. Das Hauptaugenmerk dieser Methode lag hierbei auf einer hohen chromatographischen Auflösung, einer robusten Quantifizierbarkeit und einer anwenderfreundlichen Bedienbarkeit. Die Nutzung eines elektrolytischen On-Line-Eluentengenerators, zweier serieller analytischer Säulen und zweier Detektoren (Leitfähigkeit und UV) ermöglichte eine hoch reproduzierbare Quantifizierung von über 25 Zwischenprodukten des Zentralstoffwechsels von Säugerzellen in einer Messung. Die komplexe metabolische Zusammensetzung der Proben erforderte jedoch eine bessere Auflösung der Chromatogramme. Diese Anforderung konnte durch die Kopplung eines Massen-Detektors an die bestehende Chromatographieanlage erfüllt werden. Durch die Nutzung dieses Detektors konnten zusätzlich die bereits zugeordneten Chromatographiepeaks in ihrer Identität anhand des jeweiligen charakteristischen Masse/Ladung-Verhältnisses bestätigt werden. Im zweiten Abschnitt der Arbeit wurde basierend auf Methoden der statistischen Versuchsplanung eine Probenvorbereitung für die Extraktion von intrazellulären Stoffwechselprodukten ausgewählt und optimiert. Adhärente MDCK-Zellen dienten hierbei als Modellorganismus. Zuerst wurden anhand eines experimentellen Vergleichs von Methoden aus der Literatur zwei grundsätzlich geeignete Methoden identifiziert. Anschließend wurden diese beiden Methoden in zwei aufeinander folgenden Experimenten optimiert. Hierbei dienten vier verschiedene Zielgrößen (Nukleotidgehalt, Fructose-1,6- Bisphosphat-Gehalt, Energy Charge, Absorptionswert bei 280 nm) als repräsentative Marker für ein gutes Extraktionsverhalten. Um ein Gesamtoptimum zu finden wurden die vier Zielgrößen durch die Verwendung von Desirability-Funktionen kombiniert. Ein weiterer Optimierungsschritt war erforderlich, um schlechte Wiederfindungswerte nach Standardzugabe zu Proben zu vermeiden. Hierfür wurden einzelne, essentielle Schritte der beiden zuvor optimierten Methoden kombiniert, wodurch eine robuste und verlässliche Methode zur reproduzierbaren Quantifizierung intrazellulärer Metaboliten des Zentralstoffwechsels aus kultivierten tierischen Zellen etabliert werden konnte. Im dritten Abschnitt der Arbeit wurden unterschiedliche Kultivierungsbedingungen und Zelllinien (MDCK und Vero) anhand der intrazellulären Metabolitkonzentrationen charakterisiert. Erhebliche Konzentrationsänderungen zahlreicher Metaboliten wurden über den Verlauf von Batch- Kultivierungen gemessen. Weiterhin konnte eine deutliche Abhängigkeit verschiedener intrazellulärer Konzentrationen vom Zellkulturmedium festgestellt werden. In Pulsexperimenten konnte ein deutlich unterschiedliches Antwortverhalten der intrazellulären Konzentration für verschiedene Metaboliten beobachtet werden. Insbesondere die Zwischenprodukte der Glykolyse wiesen eine sehr schnelle Reaktion auf Änderungen der Glucosekonzentration im Zellkulturüberstand auf.