Untersuchung von Glykosylierungsleistung und intrazellulären Nukleotidzucker-Konzentrationen rekombinanter CHO-Zellen unter hypothermen Kulturbedingungen

Die für die Wirksamkeit rekombinanter Glykoproteine relevanten Zuckerseitenketten machen die gentechnische Herstellung solcher Biopharmazeutika in Säugerzelllinien notwendig. Diese besitzen im Gegensatz zu Prokaryoten und einfachen Eukaryoten, wie z. B. Hefen, die erforderlichen Enzyme zur korrekten Durchführung der Glykosylierung. Die Biosynthese dieser posttranslationalen Modifikation findet in einem komplexen Netzwerk verschiedener enzymatischer Reaktionen im Endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat der Zellen statt. Externe Faktoren wie z. B. Substrat- Konzentrationen oder Prozessparameter können diesen Prozess beeinflussen, was zu Veränderungen in den Oligosaccharidstrukturen eines Glykoproteins führen kann. Diese Einflüsse wurden bereits in zahlreichen Studien untersucht (Butler, 2006). Eine genauere Untersuchung externer Faktoren auf die intrazellulären Vorgänge der Glykanbiosynthese wurde bisher allerdings nur selten vorgenommen. Daher war es Ziel dieser Arbeit, die intrazellulären Auswirkungen eines die Glykosylierung beeinflussenden Prozessparamters auf die hierbei relevanten Metabolite und Enzyme zu untersuchen. Hierfür waren die für die Glykanbiosynthese essentiellen Nukleotidzucker zu quantifizieren, welche als Bausteine der Glykane von verschiedenen Glycosyltransferasen zu Oligosacchariden verknüpft werden. Des Weiteren sollten die intrazellulären Konzentrationen der Nukleotide gemessen werden. Sie spielen eine entscheidende Rolle für die Biosynthese der Nukleotidzucker. Um diese Analyte quantifizieren zu können, mussten Methoden zur ihrer Extraktion, Präparation und Messung entwickelt werden. Neben der Entwicklung geeigneter analytischer Methoden musste ein Prozessparameter mit Einfluss auf die Glykosylierung ermittelt werden. Zum Auffinden eines solchen Prozessparameters wurde eine rekombinante CHO-Zelllinie (CHO, engl. Chinese Hamster Ovary) verwendet, welche das Glykoprotein Erythropoietin exprimierte. Unter Variation des die Glykosylierung beeinflussenden Prozessparameters sollten dann in weiteren Kultivierungen die Produktqualität hinsichtlich der Sialylierung und die Konzentrationen intrazellulärer Nukleotid- und Nukleotidzucker-Konzentrationen untersucht werden.