Aktivierung, Bindung und Umsetzung von Desoxynukleosid-5'- Monophosphaten in Oligonukleotidkomplexen

Im Rahmen dieser Arbeit wurden sowohl chemische Primerverlängerungsreaktionen als auch Bindungseigenschaften von Mononukleotiden in Oligonukleotidkomplexen untersucht. Bei der chemischen Primerverlängerung wird ein Oligonukleotid, das auf einem DNA-Templat gebunden ist, in Abwesenheit von einer Polymerase jeweils um das Nukleotid verlängert, das zur Templatbase komplementär ist. Solche Reaktionen, die Einzelschritte der Replikation von DNA nachahmen, lassen sich mit Aktivestern von Nukleosid- 5'-monophosphaten induzieren. Bei den Untersuchungen zur Beschleunigung der enzymfreien Primerverlängerungsreaktion konnte durch Zugabe von Heterozyklen eine Beschleunigung der Reaktion erreicht werden. Beim Zusatz von Pyridin, welches vermutlich als kovalenter Katalysator wirkt, war die Primerverlängerungsreaktion um einen Faktor sieben schneller als in Abwesenheit des Heterozyklus, sodass Halbwertszeiten für die Verlängerungsreaktion von weniger als einer Minute erreicht wurden. Außerdem gelang es, enzymfreie Primerverlängerungsreaktionen bei submillimolaren Monomerkonzentrationen durchzuführen. Dafür wurden Reaktionsbedingungen entwickelt, die zu einer in situ Aktivierung der Desoxynukleosid-5'-monophosphate führen. Eine Kombination des Carbodiimids EDC mit 1-Methylimidazol als Katalysator ergab einen vollständigen Umsatz des Primers bei einer Monomerkonzentration von 0.5 mM. Weiterhin wird über das Binden von Mononukleotiden an Oligonukleotid-Tripelhelices berichtet. Diese Tripelhelices enthielten eine Einzelnukleotidlücke im zentralen Strang, in die jeweils ein Mononukleotid mittels Watson-Crick- und Hoogsteen-Basenpaarung binden kann. Die entworfenen Monomer-Liganden binden Mononukleotide im Grundzustand hochaffin und basenspezifisch, wie in UV-Schmelzkurvenexperimenten nachgewiesen werden konnte. So konnte nicht nur zwischen den Kernbasen der eingesetzten Mononukleotide, sondern auch zwischen der Anzahl der Phosphatgruppen, sowie zwischen Ribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden unterschieden werden.