A novel β-glucosidase [beta-glucosidase] and a chimeric endoglucanase-CBM for cellulose hydrolysis at elevated temperatures
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In dieser Arbeit wurde eine β-Glucosidase (FiBgl1A) aus dem hyperthermophilen Bakterium Fervidobacterium islandicum isoliert, kloniert und in E. coli heterolog überexprimiert. Mittels Hitzefällung und Gelfiltration konnte FiBgl1A bis zur Homogenität gereinigt werden und wies eine spezifische Aktivität von 262 U/mg gegenüber p-nitrophenyl-β-glucopyranoside bei 90°C sowohl bei pH 6,0 als auch bei pH 7,0 auf. Die neue β-Glucosidase aus F. islandicum zeigte Eigenschaften, durch die sie für eine Vielzahl von biotechnologische Anwendungen geeignet sind könnte. Hervorzuheben ist dabei die Thermostabilität des Enzyms. Nach 20 Minuten bei 90°C wies FiBgl1A 80% Restaktivität auf. Durch die Zugabe von denaturierenden und reduzierenden Stoffen, wie pHMB (10 mM), EDTA (10 mM), Harnstoff (10 mM) oder DTT (10 mM), wurde das Enzym nicht beeinflusst. Der Zusatz von Tensiden und Lösungsmitteln (ausser SDS) verbesserte die Aktivität von FiBgl1A sogar. In Gegenwart von 50 mM Glukose trat keine Produkthemmung auf, eine positive Eigenschaft für die Anwendung dieses Enzyms in der effizienten und schnellen Hydrolyse von Cellulose zu Glukose bei hohen Temperaturen. Kohlenhydratbindende Module (engl. carbohydrate binding module = CBM) sind nicht-katalytische Module, die eine wichtige Rolle bei der Hydrolyse von kristalliner unlöslicher Cellulose spielen. In dieser Arbeit wurde die Endoglucanase Cel5A aus Thermoanaerobacter tengcongensis mit einem CBM der Familie 28 aus Calidocellulosiruptor bescii fusioniert und dadurch ein chimäres Enzym konstruiert. Das neue Protein Cel5A-CBM28 wurde in den Vektor pMal-c2x ligiert und in E. coli heterolog überexprimiert. Cel5A-CBM28 ist eine sehr thermo- und halostabile Endoglucanase, die sowohl an amorpher als auch an kristalline Cellulose (wie Avicel und regenerierte Cellulose) bindet. Das Enzym zeigt die höchste Aktivität (480 U/mg) bei 70°C und pH 6,0 und ist sowohl in einem breiten Temperaturbereich (50-90°C) als auch pH-Bereich (5,0-8,0) aktiv. Durch die Fusion der Endoglukanase mit dem CBM28 wird die Aktivität des Enzyms gegenüber löslicher Cellulose im vergleich zu der Endoglukanase ohne CBM 1,6-fach gesteigert. Die spezifische Aktivität gegenüber unlöslicher Cellulose konnte nicht verbessert werden. Das chimäre Enzym ist aktiv in Gegenwart einer Reihe von Tenside, Lösungsmittel, Denaturierungsmittel und Metallionen. Cel5A-CBM28 weist verglichen mit bereits bekannten Cellulasen eine sehr hohe spezifische Aktivität von 480 U/mg auf und ist ein geeigneter Kandidat für biotechnologische Anwendungen.
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A novel β-glucosidase [beta-glucosidase] and a chimeric endoglucanase-CBM for cellulose hydrolysis at elevated temperatures, Dina Jabbour
- Sprache
- Erscheinungsdatum
- 2011
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- Titel
- A novel β-glucosidase [beta-glucosidase] and a chimeric endoglucanase-CBM for cellulose hydrolysis at elevated temperatures
- Sprache
- Englisch
- Autor*innen
- Dina Jabbour
- Verlag
- mbv
- Erscheinungsdatum
- 2011
- ISBN10
- 3863870352
- ISBN13
- 9783863870355
- Kategorie
- Skripten & Universitätslehrbücher
- Beschreibung
- In dieser Arbeit wurde eine β-Glucosidase (FiBgl1A) aus dem hyperthermophilen Bakterium Fervidobacterium islandicum isoliert, kloniert und in E. coli heterolog überexprimiert. Mittels Hitzefällung und Gelfiltration konnte FiBgl1A bis zur Homogenität gereinigt werden und wies eine spezifische Aktivität von 262 U/mg gegenüber p-nitrophenyl-β-glucopyranoside bei 90°C sowohl bei pH 6,0 als auch bei pH 7,0 auf. Die neue β-Glucosidase aus F. islandicum zeigte Eigenschaften, durch die sie für eine Vielzahl von biotechnologische Anwendungen geeignet sind könnte. Hervorzuheben ist dabei die Thermostabilität des Enzyms. Nach 20 Minuten bei 90°C wies FiBgl1A 80% Restaktivität auf. Durch die Zugabe von denaturierenden und reduzierenden Stoffen, wie pHMB (10 mM), EDTA (10 mM), Harnstoff (10 mM) oder DTT (10 mM), wurde das Enzym nicht beeinflusst. Der Zusatz von Tensiden und Lösungsmitteln (ausser SDS) verbesserte die Aktivität von FiBgl1A sogar. In Gegenwart von 50 mM Glukose trat keine Produkthemmung auf, eine positive Eigenschaft für die Anwendung dieses Enzyms in der effizienten und schnellen Hydrolyse von Cellulose zu Glukose bei hohen Temperaturen. Kohlenhydratbindende Module (engl. carbohydrate binding module = CBM) sind nicht-katalytische Module, die eine wichtige Rolle bei der Hydrolyse von kristalliner unlöslicher Cellulose spielen. In dieser Arbeit wurde die Endoglucanase Cel5A aus Thermoanaerobacter tengcongensis mit einem CBM der Familie 28 aus Calidocellulosiruptor bescii fusioniert und dadurch ein chimäres Enzym konstruiert. Das neue Protein Cel5A-CBM28 wurde in den Vektor pMal-c2x ligiert und in E. coli heterolog überexprimiert. Cel5A-CBM28 ist eine sehr thermo- und halostabile Endoglucanase, die sowohl an amorpher als auch an kristalline Cellulose (wie Avicel und regenerierte Cellulose) bindet. Das Enzym zeigt die höchste Aktivität (480 U/mg) bei 70°C und pH 6,0 und ist sowohl in einem breiten Temperaturbereich (50-90°C) als auch pH-Bereich (5,0-8,0) aktiv. Durch die Fusion der Endoglukanase mit dem CBM28 wird die Aktivität des Enzyms gegenüber löslicher Cellulose im vergleich zu der Endoglukanase ohne CBM 1,6-fach gesteigert. Die spezifische Aktivität gegenüber unlöslicher Cellulose konnte nicht verbessert werden. Das chimäre Enzym ist aktiv in Gegenwart einer Reihe von Tenside, Lösungsmittel, Denaturierungsmittel und Metallionen. Cel5A-CBM28 weist verglichen mit bereits bekannten Cellulasen eine sehr hohe spezifische Aktivität von 480 U/mg auf und ist ein geeigneter Kandidat für biotechnologische Anwendungen.