Development of an integrated microfluidic system for metabolomic analysis of mammalian cells

Innerhalb der letzten Jahre hat es auf dem Gebiet der Systembiologie wesentliche Fortschritte gegeben, indem biologische Systeme durch einen kombinierten Ansatz aus theoretischer Modellierung und experimenteller Validierung beschrieben wurden. Während genomische, transkriptomische und proteomische Daten mit hoher Genauigkeit gewonnen werden können, gestaltet sich die Bestimmung von Metabolitenprofilen und -flüssen nach wie vor schwierig. Dies liegt einerseits an der dynamischen Spannbreite von Konzentrationen, der schnellen Umsetzung und chemischen Diversität von Metaboliten. Auf der anderen Seite mangelt es an effektiven Methoden zur schnellen Probennahme und dem Abstoppen metabolischer Aktivität (Quenching), ohne dabei wichtige Informationen zu verlieren. Insbesondere die Bestimmung von intrazellulären in vivo Metabolitenprofilen in Säugetierzellen bleibt eine große technologische Herausforderung. In der vorliegenden Arbeit wurde der Versuch unternommen, diese technologischen Limitierungen bei der metabolischen Analyse zu überwinden, indem ein mikrofluidisches System für schnelles Mischen, Abtrennen und Aufschließen von Zellen hergestellt und mit tierischen Zellen getestet wurde. Die Fluiddynamik innerhalb dieses Systems wurde mathematisch beschrieben und mit experimentellen Beobachtungen verglichen. Auf der theoretischen Seite wurden zwei Modelle entwickelt für (I) die Vorhersage des Zellaufschlusses in den entwickelten Mikromodulen und (II) die Beschreibung der Metabolitenfreisetzung aus beschädigten Zellen. Des Weiteren wurden fünf verschiedene Mikromixer mit Finite-Elementebasierten Methoden hinsichtlich ihrer Eignung für die Probenverarbeitung evaluiert. Die numerischen Ergebnisse wurden mit experimentellen Daten verglichen, welche mit verschiedenen Zelllinien in den hergestellten mikrofluidischen Systemen gewonnen wurden. Eine deutliche Korrelation zwischen Fließgeschwindigkeit und Zellaufschluss konnte gezeigt werden. Die berechnete Energiedissipation für den Aufschluss von 50% der Zellen liegt je nach Zelldurchmesser im Bereich von 5.56x107-2:42x108 Wm-3 und stimmt somit mit bekannten Literaturdaten überein. Das Model für die Metabolitenfreisetzung wurde zur Beschreibung des Austritts von grün fluoreszierendem Protein (GFP) aus beschädigten Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zellen angewendet und die zerstörte Membranfläche der untersuchten Zellen wurde berechnet. Die experimentelle Validierung der Mischgüte für die hergestellten Split-and- Recombine-Mischer stimmt mit den numerischen Ergebnissen überein, ergibt jedoch im Allgemeinen eine geringere Mischleistung verglichen mit Werten aus der Literatur. Eines der größten Probleme stellte die Verstopfung von Mikrokanälen mit Zelltrümmern und anderen Verunreinigungen aus dem Kultivierungsmedium dar, wodurch der Zellaufschluss gestört und eine erfolgreiche Zellabtrennung weitestgehend verhindert wurde. Der derzeitige experimentelle Ansatz für eine integrierte mikrofluidische Probenverarbeitung muss verfeinert werden, um dem Umgang mit Säugetierzellen für die metabolische Analyse gerecht zu werden. Dennoch konnte gezeigt werden, dass in der mikrofluidischen Systementwicklung mit simultaner numerischer Modellierung ein vielversprechender Ansatz steckt, um Limitierungen der aktuellen Methodik zur metabolischen Analyse zu überwinden.