Prozessnahe Hochdurchsatzoptimierung der heterologen Proteinproduktion in alternativen Wirtsorganismen
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In dieser Arbeit wird die Entwicklung automatisierter Hochdurchsatzmethoden zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion beschrieben. Hierzu werden im ersten Teil der Arbeit die technischen Voraussetzungen geschaffen, indem eine automatisierte Kultivierungsplattform - dem Jülich Bioprocess Optimization System (JuBOS) - konzipiert und validiert wird. Die beiden Hauptinstrumente sind hierbei ein Mikrotiterplatten (MTP) - basiertes Kultivierungssystem und ein angebundener Pipettierroboter, durch den u. a. ein Flüssigkeitstransfer in und aus den einzelnen MTP-Kavitäten ermöglicht wird. Funktionale Erweiterungen des Systems durch weitere Instrumente ermöglichen auf dem JuBOS automatisierte mikrobielle Arbeiten wie z. B. Probenahme und Aktivitätsassays. Durch eine Maßstabsvergrößerung verschiedener MTP-Kultivierungen in Labor-Bioreaktoren (1 L, 20 L) wird die Validität der Ergebnisse nachgewiesen. In dem zweiten Teil der Arbeit werden auf dem JuBOS vier Methodenmodule zur beschleunigten Bioprozessentwicklung der heterologen Proteinproduktion entwickelt. Als Modellprotein wurde hierzu Cutinase aus Fusarium solani pisi verwendet, sekretorisch produziert mit Corynebacterium glutamicum. In dem ersten Methodenmodul werden aus einer Signalpeptid-Bibliothek durch ein automatisiertes Stammscreening die produktivsten Cutinase-Signalpeptid- Kombinationen identifiziert. Als bioverfahrenstechnische Optimierung wird mit der Methode des sogenannten Induction Profilings optimale Kombinationen von IPTG-Konzentration und Induktionszeitpunkt verschiedener Modellproteine untersucht. Neben einer Produktivitätssteigerung von 40% wird ebenfalls ein deutlicher Einfluss des Zielproteins selbst deutlich. Als weiterer Parameter wird das Minimalmediums CG XII hinsichtlich maximaler Proteinproduktion mit C. glutamicum optimiert. Durch ein Screening von 19 Medienkomponenten und einer Algorithmen- basierten Optimierung wird ein neues Minimalmedium entwickelt, mit dem die Ausbeute von zwei Zielproteinen um den Faktor 1.5 gesteigert wird. Als abschließende Methode zur Bioprozessoptimierung wird die Möglichkeit zur Miniaturisierung von Fed-Batch-Prozessen mit Hilfe eines enzymatischen Glucose-Release-Mediums untersucht. Hierdurch ist eine systematische Variation der linearen Feedrate bereits in Mikrotiterplatten möglich und die biomassespezifische Produktbildung um 100% gesteigert. Im einfachsten Fall einer Prozessoptimierung werden diese beschriebenen Methoden nacheinander abgearbeitet. Bei einer solchen Kette von Optimierungsschritten wird mit dem JuBOS der Durchsatz einer Bioprozessentwicklung um den Faktor 17 im Vergleich zu parallelen Bioreaktorkultivierungen gesteigert.
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Prozessnahe Hochdurchsatzoptimierung der heterologen Proteinproduktion in alternativen Wirtsorganismen, Peter Rohe
- Sprache
- Erscheinungsdatum
- 2012
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- Titel
- Prozessnahe Hochdurchsatzoptimierung der heterologen Proteinproduktion in alternativen Wirtsorganismen
- Sprache
- Deutsch
- Autor*innen
- Peter Rohe
- Erscheinungsdatum
- 2012
- ISBN10
- 3893368345
- ISBN13
- 9783893368341
- Kategorie
- Skripten & Universitätslehrbücher
- Beschreibung
- In dieser Arbeit wird die Entwicklung automatisierter Hochdurchsatzmethoden zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion beschrieben. Hierzu werden im ersten Teil der Arbeit die technischen Voraussetzungen geschaffen, indem eine automatisierte Kultivierungsplattform - dem Jülich Bioprocess Optimization System (JuBOS) - konzipiert und validiert wird. Die beiden Hauptinstrumente sind hierbei ein Mikrotiterplatten (MTP) - basiertes Kultivierungssystem und ein angebundener Pipettierroboter, durch den u. a. ein Flüssigkeitstransfer in und aus den einzelnen MTP-Kavitäten ermöglicht wird. Funktionale Erweiterungen des Systems durch weitere Instrumente ermöglichen auf dem JuBOS automatisierte mikrobielle Arbeiten wie z. B. Probenahme und Aktivitätsassays. Durch eine Maßstabsvergrößerung verschiedener MTP-Kultivierungen in Labor-Bioreaktoren (1 L, 20 L) wird die Validität der Ergebnisse nachgewiesen. In dem zweiten Teil der Arbeit werden auf dem JuBOS vier Methodenmodule zur beschleunigten Bioprozessentwicklung der heterologen Proteinproduktion entwickelt. Als Modellprotein wurde hierzu Cutinase aus Fusarium solani pisi verwendet, sekretorisch produziert mit Corynebacterium glutamicum. In dem ersten Methodenmodul werden aus einer Signalpeptid-Bibliothek durch ein automatisiertes Stammscreening die produktivsten Cutinase-Signalpeptid- Kombinationen identifiziert. Als bioverfahrenstechnische Optimierung wird mit der Methode des sogenannten Induction Profilings optimale Kombinationen von IPTG-Konzentration und Induktionszeitpunkt verschiedener Modellproteine untersucht. Neben einer Produktivitätssteigerung von 40% wird ebenfalls ein deutlicher Einfluss des Zielproteins selbst deutlich. Als weiterer Parameter wird das Minimalmediums CG XII hinsichtlich maximaler Proteinproduktion mit C. glutamicum optimiert. Durch ein Screening von 19 Medienkomponenten und einer Algorithmen- basierten Optimierung wird ein neues Minimalmedium entwickelt, mit dem die Ausbeute von zwei Zielproteinen um den Faktor 1.5 gesteigert wird. Als abschließende Methode zur Bioprozessoptimierung wird die Möglichkeit zur Miniaturisierung von Fed-Batch-Prozessen mit Hilfe eines enzymatischen Glucose-Release-Mediums untersucht. Hierdurch ist eine systematische Variation der linearen Feedrate bereits in Mikrotiterplatten möglich und die biomassespezifische Produktbildung um 100% gesteigert. Im einfachsten Fall einer Prozessoptimierung werden diese beschriebenen Methoden nacheinander abgearbeitet. Bei einer solchen Kette von Optimierungsschritten wird mit dem JuBOS der Durchsatz einer Bioprozessentwicklung um den Faktor 17 im Vergleich zu parallelen Bioreaktorkultivierungen gesteigert.