Das neuronale Differenzierungspotenzial von caninen mesenchymalen Stammzellen aus dem Fettgewebe

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem neuronalen Differenzierungspotenzial caniner mesenchymaler Stammzellen aus dem Fettgewebe. Ziel der Arbeit war es, canine ASCs zunächst näher zu charakterisieren und anschließend ihre Fähigkeit, neuronal zu differenzieren, zu untersuchen. Hierfür wurden Stammzellen aus dem Fettgwebe von neun Hunden in undifferenziertem Zustand zunächst auf ihre Differenzierungsfähigkeit und ihre Expressionsmuster charakterisiert. Diese Zellen ließen sich in eine adipogene, chondrogene und osteogene Linie differenzieren. Des Weiteren waren sie positiv für die Expression der Zelloberflächenmarker CD90 und CD105. Aufgrund dessen konnten sie als Stammzellen identifiziert und für die weiteren Versuche verwendet weden. In in vitro Untersuchungen wurden die Zellen mithilfe eines neuronalen Induktionsmediums, bestehend aus Insulin, Forskolin, Kaliumchlorid, Butylhydroxyanisol, Valproinsäure und Hydrocortison, neuronal differenziert. Weitere Analysen der Zellen wurden zu den Zeitpunkten 3h, 24h und 72h nach Differenzierungsinduktion durchgeführt. Nicht differenzierte Zellen dienten hierbei als negativ-Kontrollgruppe. Canines Hirngewebe diente als Positivkontrolle. Anhand von lichtmikroskopischen Untersuchungen konnte eine veränderte Morphologie der Zellen bereits nach einer Stunde Differenzierung festgestellt werden. Dabei zog sich das Zytoplasma in Richtung des Somas zusammen und bildete mehrere, zunächst primär, später auch sekundär und tertiär verzweigte Ausläufer aus. Neben der morphologischen Untersuchung erfolgte die Analyse der Genexpression neuronaler und glialer Marker. Dieser Nachweis wurde mittels quantitativer Polymerasekettenreaktion durchgeführt. Untersucht wurden hierbei die Expressionsmuster der neuronalen Marker ß-III-Tubulin, MAP2, Nestin und des glialen Markers GFAP. Ebenso erfolgte die Auswertung der Expression der Neurotrophine NGF, BDNF und GDNF. Dabei fiel auf, dass cASCs bereits in einem undifferenzierten Zustand neuronale Marker sowie alle untersuchten Neurotrophine exprimierten. Lediglich GFAP konnte weder in undifferenzierten noch in differenzierten cASCs nachgewiesen werden. Allerdings konnte die Expression alle Marker, auch eine GFAP-Expression, im caninen Hirngewebe demonstriert werden. In neuronal differenzierten Zellen zeigte sich im Differenzierungsverlauf eine veränderte Expression der Marker. Das Expressionsmuster von MAP2 stieg im Laufe der Differenzierung signifikant an. Die Expression von BDNF und GDNF stieg ebenfalls an, allerdings weniger deutlich als MAP2. NGF wurde hingegen 24h nach neuronaler Differenzierung signifikant niedriger exprimiert als nach 3h Differenzierung. Ebenso sank die Expression der Marker Nestin und ß-III-Tubulin 24h nach Induktionsbeginn signifikant ab. Mittels Immunhistochemie konnten MAP2, Nestin, ß-III-Tubulin, GFAP und A2B5 positiv in differenzierten sowie undifferenzierten Zellen nachgewiesen werden. Anhand des Western Blots konnte gezeigt werden, dass sich nicht nur die mRNA in den Zellen verändert, sondern dass auch neurale Proteine innerhalb der differenzierten Zellen translatiert werden. Die hier gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass sich canine ASCs durch eine neuronale Induktion neuronal differenzieren lassen und eine Neuronen-ähnliche Morphologie, sowie veränderte Gen- und Proteinexpressionen aufzeigen. Somit bietet diese Erkenntnis Anlass zu einer weiteren Erforschung der neuronalen Differenzierung von caninen Stammzellen aus dem Fettgewebe für einen künftigen Einsatz in der Veterinär- und Humanmedizin.