Charakterisierung des cGMP-Signalweges im Nebenhoden und in transfizierten HEK-Zellen

Signalwege, bei denen cGMP als sekundärer Botenstoff dient, sind in vielen Organen an der Regulation physiologischer Prozesse beteiligt. Ihre lokale Bedeutung im Nebenhoden und die zellulären Mechanismen zur Gewährleistung kompartmentalisierter Aktivitäten sind bisher nur teilweise aufgeklärt. Um Hinweise auf den Stellenwert von cGMP-Signalaktivitäten im Verlauf des Nebenhodengangs zu erlangen, wurden potentiell beteiligte Faktoren in verschiedenen Regionen (Caput, Corpus, Cauda) des Rattennebenhodens untersucht. Die Ergebnisse dokumentierten das Vorkommen von Proteinen mit Einfluss auf die Generierung (NPR-A, NPR-B, NEP, sGC, eNOS, nNOS), den Abbau (PDE5) und die zelluläre Wirksamkeit (PKG) von cGMP. Unterschiedliche Konzentrationen dieser Proteine in den Nebenhodenabschnitten und eine spezifische Zunahme von membranassoziierten Proteinspiegeln (sGC, PKG) im Verlauf des Nebenhodengangs erlauben Rückschlüsse auf Region-spezifische Besonderheiten bei cGMP-vermittelten Signalaktivitäten in diesem Organ. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Modellsystem (HEK-Zellen) verwendet, um Erkenntnisse über Interaktionen zwischen verschiedenen cGMP-erzeugenden Systemen, cGMP-degradierenden Faktoren und cGMP-Zielproteinen zu erhalten. Diese Studien zeigten, dass eine erhöhte membranständige cGMP-Produktion (infolge einer Überexpression von NPR-A) eine hochspezifische Translokation der cGMP-abhängigen Kinase PKG I an die Zellmembran auslöst. Weitere identifizierte Effekte waren 1. eine drastische Reduktion der Aktivität und Proteinspiegel von sGC, einem anderen cGMP-generierenden Enzym, und 2. eine Hochregulation von cGMP-degradierender Aktivität und PDE5-Protein in den Zellen, die in allen Fällen sowohl an den Membranen als auch im Cytosol evident war. Nach Evaluierung und Weiterentwicklung eines Assays zur Analyse von cGMP-abbauenden Enzymen konnte gezeigt werden, dass PDE5, aber nicht die PDEs 1, 2 oder 3, für die Zunahme der cGMP-degradierenden Aktivität bei Überexpression von NPR-A verantwortlich ist. Die Ergebnisse bestätigten frühere Befunde einer NPR-A-induzierten Translokation von PKG I zur Membran und zeigten, dass diese Reaktion hochspezifisch ist (cAMP-abhängige Kinasen sind nicht betroffen) und auch ohne Stimulierung des Rezeptors erfolgen kann. Die Experimente offenbarten zudem erstmals eine funktionelle Interaktion auf der Ebene der beiden (NPR-A, sGC) cGMP-generierenden Systeme und einen zellulären Reaktionsmechanismus, der bei erhöhter membranständiger cGMP-Produktion die Zunahme von PDE5-Aktivität auslöst.