Charakterisierung des genetisch kodierten Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Sensors „Mermaid“ zur Messung einer Änderung des Plasmamembranpotentials pulmonalarterieller glatter Muskelzellen unter hypoxischen Bedingungen

Die Hypoxische Pulmonale Vasokonstriktion ist ein spezieller Mechanismus des pulmonalen Gefäßbettes zur Optimierung der Oxygenierung des Blutes bei lokaler oder generalisierter alveolärer Hypoxie durch Umverteilung des Blutes von schlecht belüfteten Lungenabschnitte in gut ventilierte Bereiche. Die Sensor- sowie Effektorzellen dieses Mechanismus sind präkapilläre pulmonalarterielle glatte Muskelzellen (PASMC). In der Vermittlung der ersten akuten Phase der HPV spielt der Ionenkanal TRPC6 eine essentielle Rolle, wobei die Signaltransduktionskaskade der Aktivierung noch nicht im Detail entschlüsselt ist. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Mermaid zur Messung von Membranspannungsänderungen in PASMC der Maus, die aus einer Hypoxie-induzierten TRPC6-Aktivierung resultieren, um über diese Arbeit hinaus zur weiteren Entschlüsselung der TRPC6-aktivierenden Signaltransduktionskaskade zu dienen. Es wurden präkapilläre PASMC der Maus isoliert und mit Mermaid-Sequenz-enthaltenden Lentiviren infiziert. Nach Expression des FRET-Sensors in der Plasmamembran der PASMC wurde die Sensorreaktion bei Membranspannungsänderungen mithilfe unterschiedlicher Stimuli charakterisiert. Die Verifizierung der Sensorfunktionalität mit KCl in unterschiedlichen Konzentrationen zeigte nur für die höheren Konzentrationen eine gute Unterscheidbarkeit der unterschiedlichen Stimulierungsstärken, wobei die schwächste Konzentrationsstufe keinen signifikanten Unterschied zeigte. Die direkte Aktivierung von TRPC6 mit seinem membranpermeablen Aktivator OAG zeigte für alle verwendeten Konzentrationen keine mithilfe von Mermaid gemessene Membranspannungsänderung. Auch die Applikation von Hypoxie unter gleichzeitigem Priming durch den Vasokonstriktor ET-1 zeigte bei den vorliegenden Versuchsbedingungen keine mit Mermaid messbare Membranspannungsänderung im Vergleich zu normoxischen Kontrollen. Dass die in der vorliegenden Arbeit untersuchten PASMC der Maus eine Hypoxie-induzierte Membranspannungsänderung indirekt zeigen können, wurde mithilfe der auf Fura 2 AM basierten Mangan-Quenching Methode verifiziert. Zusammengefasst zeigte sich der FRET-Sensor Mermaid im vorliegenden Versuchsaufbau nicht geeignet zur Messung einer Hypoxie-induzierten Änderung der Plasmamembranspannung in präkapillären PASMC der Maus.